Le preoccupazioni per la salute pubblica in merito alla sicurezza alimentare dal punto di vista microbiologico sono aumentate in tutto il mondo negli ultimi anni.
Si stima che solo negli Stati Uniti quasi 9,4 milioni di persone ammalate, 55.961 ricoveri e 1.351 decessi siano causati ogni anno dal consumo di alimenti contaminati da 31 patogeni alimentari.
Infezioni o epidemie causate da questi patogeni possono essere il risultato del consumo di alimenti contaminati, tra cui carne bovina, latticini, verdure fresche e acqua contaminata.
Pertanto, è importante monitorare e controllare i principali agenti patogeni noti nella lavorazione degli alimenti e nelle condizioni ambientali.
I microrganismi sono sottoposti a diverse condizioni di stress non solo in natura, ma anche durante la lavorazione degli alimenti, e ciò rappresenta per loro una grande sfida per sopravvivere anche in condizioni avverse.
Di conseguenza, i microrganismi hanno sviluppato strategie adattive uniche per resistere e mantenere la sopravvivenza in condizioni ostili.
Difatti durante la lavorazione degli alimenti l’esposizione a condizioni avverse come il riscaldamento, il congelamento, l’essiccazione, la liofilizzazione, l’irradiazione (es. UV), l’elevata pressione idrostatica, la fermentazione o l’aggiunta di antimicrobici e sostanze chimiche, può provocare diversi stati fisiologici nei batteri, e aumentare la possibilità di indurre il passaggio a meccanismi di sopravvivenza tra cui la formazione di spore oppure il passaggio per i microrganismi non sporigeni a cellule nello stato vitale ma non coltivabile (VBNC, viable but not colturable cell).
Ad oggi sono state individuate più di 60 specie batteriche in grado di entrare nello stato VBNC, tra cui Escherichia, Vibrio, Listeria e Pseudomonas.
Proprietà delle cellule VBNC
Le cellule VBNC hanno alcune caratteristiche specifiche.
Rispetto alle cellule morte, le cellule VBNC hanno una membrana intatta, mantengono con successo l’espressione genica ed evitano perdite citoplasmatiche.
Al contrario, le cellule morte hanno una membrana danneggiata e sono metabolicamente inattive.
Allo stesso modo, rispetto alle cellule vitali e sub-letalmente danneggiate, le cellule VBNC non possono crescere nel mezzo standard, che è un carattere specifico delle cellule VBNC. Inoltre, esistono differenze fisiologiche e molecolari tra le cellule VBNC e le cellule vitali e coltivabili, comprese le composizioni della parete cellulare e della membrana, l’espressione genica, le proprietà di adesione, il potenziale di virulenza, il metabolismo, la morfologia cellulare e la resistenza fisica e chimica.
Ad esempio, la riduzione delle dimensioni delle cellule è stata riscontrata in VBNC E. coli, mentre per alcune cellule VBNC sono state descritte nanezza cellulare e cellule rotonde. Inoltre, le cellule VBNC hanno un basso metabolismo e un alto livello di ATP. Tuttavia, il meccanismo mediante il quale i batteri si adattano allo stato VBNC rimane poco chiaro.
La capacità di tornare allo stato vitale è anch’essa una caratteristica vantaggiosa delle cellule VBNC, e in letteratura scientifica questo processo viene descritto come “resuscitation”. La risuscitazione è una caratteristica molto importante per i batteri VBNC. Le cellule VBNC che rispondono a stimoli ambientali appropriati, come un aumento della temperatura o l’aggiunta di nutrienti, diventano nuovamente metabolicamente attivi e coltivabili.
Questo implica che durante la lavorazione degli alimenti potrebbero essere fornite delle condizioni adeguate alla risuscitazione di batteri VBNC, determinando un rischio in materia di qualità e sicurezza alimentare. Difatti molti batteri patogeni nello stato VBNC non sono in grado di avviare un’infezione, ma mantengono il potenziale di virulenza, che verrà espresso solo a seguito della risuscitazione.
Per questo motivo il loro controllo comporta una grande sfida per l’industria alimentare.
Identificazione delle cellule VBNC
Nello stato VBNC i batteri non possono crescere su terreni convenzionali e possono quindi eludere i metodi di rilevamento convenzionali.
Difatti i microrganismi nello stato non coltivabile, non crescendo sui terreni batteriologici di routine su cui normalmente crescerebbero e si svilupperebbero in colonie, possono causare numerosi falsi negativi. Un esempio è riportato in basso per E. coli, dove la presenza di VBNC di E. coli rende più difficile il suo monitoraggio ed è probabile che produca risultati falsi negativi.
Ne deriva che, se per molto tempo si è creduto che una cellula batterica fosse morta quando non era più in grado di crescere sui normali terreni di coltura, ora sappiamo che questo presupposto è semplicistico e che ci sono molte situazioni in cui una cellula perde la coltivabilità ma rimane vitale e potenzialmente in grado di ricrescere.
A causa di ciò il rilevamento delle cellule VBNC rappresenta una sfida importante in quanto possono essere la fonte di un potenziale rischio per la sicurezza alimentare e la salute dell’uomo.
Poiché le cellule nello stato VBNC non sono più coltivabili, è necessario utilizzare metodi di “non-coltura” alternativi al fine di dimostrare che le cellule in questo stato vive. In basso in tabella vengono elencati alcuni dei metodi riportati in letteratura che possono essere utilizzati per rilevare le cellule VBNC. A questi si affiancano approcci ancora più moderni quali la metagenomica, che combina la PCR con l’analisi bioinformatica, e la tecnologia MALDI-TOF.
I progressi nelle tecnologie molecolari hanno permesso di comprendere come le metodiche tradizionali di microbiologia sono in grado, per esempio, di stimare meno dell’1% delle circa 109 cellule batteriche in un grammo di terreno.
Questi studi hanno concluso che i tempi di incubazione standard utilizzati negli esperimenti di laboratorio, erano insufficienti per la crescita batterica di un certo numero di ceppi microbici e buona parte di questa sottostima è dovuta alla presenza di cellule non coltivabili.
La mancanza di informazioni che esiste del restante 99% della popolazione microbica non è trascurabile in quanto può essere determinante per comprendere diversi fenomeni quali formazione di biofilm, l’insorgenza di resistenze, il quorum sensing (QM), i cui meccanismi devono ancora essere esattamente decifrati in molte specie.
L’approccio di Piramide e Realco
Per i motivi sopra citati, risulta essenziale per l’industria alimentare (e non solo) attuare delle azioni specifiche per il controllo delle contaminazioni da biofilm.
A tale scopo risulta utile l’applicazione del brevetto Biorem®, che tramite l’azione di più classi enzimatiche selezionate per la loro attività specifica sui biofilm, permette di eliminare in modo efficace il biofilm sia in impianti chiusi e su superfici aperte, riducendo il rischio legato alla presenza di microrganismi nello stato di cellula non coltivabile, e alla loro eventuale risuscitazione.
Il supporto di Piramide e del suo team di esperti non si ferma al trattamento Biorem®, ma affianca a questo la fase di studio e caratterizzazione dei contaminanti contenuti nella soluzione di lavaggio Biorem®.
L’indagine è effettuata non solo tramite metodi di microbiologia tradizionale, ma anche con approcci più moderni quali la metagenomica e la citofluorimetria.
Ciò permette così di avere una fotografia più vicina alla realtà della popolazione microbica presente in un determinato ambiente, e quindi andare oltre il limite dell’1% di identificazione.
Le competenze tecniche e scientifiche di Piramide supportano il cliente ad una corretta interpretazione dei dati e alla definizione di protocolli specifici di prevenzione e di screening.
Riferimenti bibliografici
- Significance of Viable but Nonculturable Escherichia coli: Induction, Detection, and Control (Tian Ding et al., 2016)
- Effects of quorum sensing on the biofilm formation and viable but non-culturable state ( Jiahui Li et. Al, 2020)
- Roles of Aerotolerance, Biofilm Formation, and Viable but Non-Culturable State in the Survival of Campylobacter jejuni in Poultry Processing Environments (Diksha Pokhrel et al., 2022)
- Viable but non-culturable (VBNC) bacteria: Gene expression in planktonic and biofilm cells (J.T. Trevors, 2011)
- Biofilms in drinking water and their role as reservoir for pathogens (Jost Wingender et al., 2011)
- UV Disinfection Induces a Vbnc State in Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa (Shenghua Zhang et al., 2016)
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