Approcci di Caratterizzazione e Implicazioni per la Sicurezza del Prodotto
La produzione di birra, pur essendo intrinsecamente legata all’attività microbica dei lieviti di birra, è costantemente minacciata dalla crescita indesiderata di microrganismi contaminanti.
Tali contaminazioni possono verificarsi in diverse fasi del processo, ma quasi la metà di tutti gli eventi di contaminazione nel settore della birra si attribuisce alle fasi finali, in particolare all’area di riempimento (imbottigliamento, inscatolamento o infustamento).
È in queste fasi critiche che i biofilm emergono come un fattore determinante per la persistenza della contaminazione. Nonostante l’impiego di strategie di detersione e disinfezione automatizzate, come i sistemi Cleaning-in-Place (CIP), i microrganismi hanno sviluppato meccanismi di sopravvivenza che consentono loro di resistere a tali procedure.
Comprendere i Biofilm: Struttura e Formazione
Un biofilm è un consorzio di microrganismi incorporati in una matrice di sostanze polimeriche extracellulari (EPS) da essi stessi prodotte.
Questa matrice, che agisce come scudo protettivo, permette ai microbi di tollerare diverse condizioni di stress, quali disinfezione, radiazioni UV e disidratazione.
La formazione del biofilm è un processo graduale:
- Adesione Iniziale: Il processo inizia con l’adesione dei microrganismi a una superficie, facilitata dalla presenza di un “film di condizionamento”, ovvero sostanze organiche (come residui di birra) che si depositano sulla superficie.
- Produzione di EPS: Dopo un’adesione irreversibile, i microrganismi iniziano a secernere EPS, che, insieme ad acqua e residui ambientali, formano la matrice del biofilm. Le molecole di EPS sono tipicamente carboidrati, DNA extracellulare (eDNA) e proteine, ma anche strutture batteriche extracellulari come flagelli, pili e fimbrie contribuiscono a stabilizzare la matrice.
- Maturazione e Distacco: All’interno del biofilm, le cellule proliferano e la matrice si ispessisce. Il distacco di cellule o cluster di cellule dal biofilm maturo è l’ultima fase del ciclo di vita e rappresenta il meccanismo principale attraverso cui la contaminazione del prodotto si propaga nell’industria alimentare.
Il paradosso della birra: un ambiente ostile alla maggior parte dei microrganismi indesiderati ma vulnerabile ai biofilm.
La birra è intrinsecamente un ambiente ostile per la maggior parte dei microrganismi a causa del suo basso pH, della concentrazione di amaro del luppolo e del contenuto di etanolo e CO2.
Tuttavia, un numero limitato di batteri alteranti e specie di lieviti, capaci di prosperare in birra, possono essere trovati nell’ambiente di produzione. Specie batteriche alteranti comuni includono generi come Lactobacillus, Pediococcus, Pectinatus e Megasphaera, mentre tra i lieviti troviamo Saccharomyces e Dekkera. Il più problematico organismo alterante della birra è Lactobacillus brevis, noto per la sua capacità di formare biofilm.
È stato inoltre dimostrato che la birra diluita (ad esempio, con acqua) può favorire una maggiore formazione di biofilm rispetto alla birra pura, probabilmente a causa della diluizione dei composti ostili come etanolo, CO2 e acidi amari del luppolo. Le aree di riempimento, dove i residui di birra possono essere diluiti con acqua di pulizia, potrebbero quindi supportare la formazione di biofilm da parte di L. brevis.
La stretta relazione tra presenza di biofilm e linee di confezionamento
Un recente studio ha cercato di caratterizzare lo stato microbico e la presenza di potenziali biofilm lungo una linea di riempimento di lattine di birra. Durante lo studio sono stati campionati 23 punti critici (incluse superfici a contatto con alimenti, FCS, e superfici non a contatto con alimenti, NFCS) in due momenti distinti: durante il funzionamento e dopo le procedure di pulizia e disinfezione.
La linea di confezionamento oggetto dello studio era sottoposta a un protocollo di pulizia automatizzato in loco (CIP) oltre che l’applicazione regolare di schiuma acida ogni 8 ore. Inoltre, veniva eseguita una pulizia manuale due volte a settimana.
Il rilevamento dei microrganismi (batteri e lieviti) è stato effettuato tramite qPCR (quantitative Polymerase Chain Reaction) in tempo reale, un metodo altamente sensibile per quantificare batteri e lieviti. Per il rilevamento dei biofilm, è stata implementata l’analisi dei componenti della matrice EPS: carboidrati (determinati tramite il metodo fenolo-acido solforico), eDNA (precipitato e quantificato spettrofotometricamente) e proteine (precipitate e analizzate mediante SDS-PAGE).
Lo studio ha permesso di raccogliere una serie di osservazioni sotto riassunte:
- Presenza di Microrganismi Durante il Funzionamento: Durante il funzionamento, nove punti (39%) sono risultati contaminati da batteri, con cariche che variavano da 0,39 log ufc/cm² a 6,19 log ufc/cm². In cinque di questi punti, è stata rilevata anche la presenza di lieviti, con cariche fino a 7,36 log ufc/cm². Tutti i punti indagati presentavano cariche microbiche superiori rispetto alla birra stessa. Hanno mostrato contaminazioni superfici a contatto con alimenti (FCS) come il bubble breaker (sito A) e le guarnizioni dei filler (siti E, F), in accordo con studi precedenti.
- Efficacia Parziale delle Procedure di Pulizia: Dopo la pulizia e la disinfezione, la presenza di lieviti è stata confermata in tre punti (13,01%), inclusi due che erano positivi anche durante il funzionamento (ruota a stella e zona di riempimento). Nessun residuo di DNA batterico è stato rilevato dopo la pulizia. Tuttavia, in un sito (sito K: ruota a stella della riempitrice), il carico fungino è addirittura risultato maggiore dopo la pulizia. Questo suggerisce che il CIP potrebbe non ridurre significativamente la contaminazione microbica in alcuni casi, e potrebbe persino favorire la proliferazione di alcune specie riducendo la competizione microbica.
- Rilevamento dei componenti della matrice e hotspot di biofilm:
- La rilevazione dei componenti della matrice è fondamentale per distinguere i microrganismi adesi dai veri biofilm. Carboidrati, proteine ed eDNA sono stati rilevati in 16 punti durante il funzionamento e in quattro punti dopo la pulizia e disinfezione.
- I carboidrati sono stati rilevati in 16 punti durante il funzionamento e in quattro punti dopo la pulizia, indicando che le strategie di pulizia non li rimuovono completamente.
- Nessun eDNA o proteina è stato rilevabile dopo la pulizia e disinfezione.
- Identificazione di un hotspot di biofilm: Sotto la riempitrice (punto NFCS) è stato identificato come un potenziale hotspot di biofilm. Durante la produzione, questo sito presentava un’alta carica di batteri (6,19 log BCE/cm²) e lieviti (7,36 log SE/cm²), ed erano presenti tutti i componenti EPS testati (carboidrati, proteine, eDNA). Inoltre, il profilo proteico rilevato in questo sito era diverso da quello della birra, rafforzando l’ipotesi della presenza di un biofilm.
Questo studio sottolinea l’importanza di considerare i biofilm come una fonte persistente e significativa di contaminazione nelle linee di riempimento della birra.
- Inefficacia delle pulizie convenzionali: Sebbene le procedure di pulizia possano ridurre il carico microbico, non sono sempre efficaci nel rimuovere completamente tutti i microrganismi e, in particolare, i biofilm. La matrice protettiva degli EPS rende i microrganismi nei biofilm molto più resistenti ai disinfettanti e agli agenti di pulizia.
- Ruolo dei residui di birra: I residui di birra e altre sostanze organiche fungono da “film di condizionamento” e possono promuovere attivamente la formazione di biofilm, specialmente se diluiti.
- Superfici non a contatto con alimenti (NFCS): L’identificazione della zona al di sotto della linea di confezionamento come un hotspot di biofilm dimostra che anche le superfici non direttamente a contatto con il prodotto possono fungere da serbatoi di contaminazione e meritano un’attenzione particolare nelle strategie di igiene. Le superfici orizzontali e le linee di imbottigliamento sono risultate più suscettibili alla formazione di biofilm rispetto alle superfici verticali e alle macchine per il confezionamento.
- Necessità di approcci mirati: La semplice rilevazione dei microrganismi non è sufficiente; l’analisi dei componenti della matrice (carboidrati, eDNA, proteine) è cruciale per identificare la presenza effettiva di biofilm. I residui di componenti della matrice possono fungere da punto di partenza per lo sviluppo di nuovi biofilm.
Strategie di controllo e prevenzione
Questo lavoro ha fornito una comprensione più approfondita dei biofilm e dei microrganismi presenti nelle linee di riempimento delle bevande a base di birra. Per i birrai, è imperativo sviluppare strategie di prevenzione ed eradicazione dei biofilm basate su una conoscenza approfondita della loro composizione e dei meccanismi di resistenza. Ciò potrebbe includere:
- la revisione delle procedure CIP per garantire una rimozione più efficace dei residui organici
- l’introduzione di protocolli mirati per la rimozione di biofilm
- l’adozione di metodi analitici per il monitoraggio dell’igiene ambientale basati non solo sulla ricerca di potenziali agenti contaminanti, ma anche di tracce organiche
L’esperienza decennale maturata da Piramide e Realco nel settore birrifici ha portato a individuare per i punti sopra citati, delle soluzioni efficaci al fine di garantire al birraio la massima riduzione del rischio, fornendo inoltre soluzioni per il controllo quotidiano dell’igiene dei propri impianti.
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Biorem®, brevetto da noi applicato nel settore birrario da molti anni, consente l’idrolisi della matrice dei biofilm, con conseguente completa eradicazione.
La possibilità, inoltre, di eseguire delle analisi microbiologiche della soluzione di lavaggio, porta ad una conoscenza e comprensione molto più approfondita della problematica/stato d’igiene della macchina.
Infine, grazie alla collaborazione con il ns partner Sacco, Piramide è in grado di fornirvi le migliori soluzioni per il monitoraggio dell’igiene ambientale quali:
- Kit per la ricerca di beer spoiler su superfici e punti critici
- Kit per la ricerca di residui organici su superfici e punti critici
- Bioluminometro per la determinazione dell’ATP presente su superfici e acque di risciacquo
Il tutto è corredato dal supporto dei ns tecnici.
