In questo articolo parliamo di latte contaminato e della relazione tra presenza di bacillacee e prodotti UHT, nota da quando sono state isolate per la prima volta nel latte UHT.
Il latte UHT, ottenuto sottoponendo il latte a trattamento termico minimo di 135°C per 1 sec. (ma normalmente trattato a temperature comprese tra 135°C e 150°C per 1-8 secondi in flusso continuo) seguito dall’immediato confezionamento asettico in contenitori presterilizzati è virtualmente e commercialmente sterile perché il trattamento termico inattiva le forme batteriche vegetative e le loro spore.
Dopo il riscaldamento, il latte UHT è conservato a temperatura ambiente. Secondo le norme europee, tale tipo di latte confezionato può contenere meno di 10 ufc/ml di cellule batteriche dopo incubazione a 30°Cper 15 gg.
Le possibili contaminazione latte, talvolta, si verificano in seguito a ri-contaminazione durante il riempimento dei contenitori, e/o sono dovute all’attività proteolitica e lipolitica degli sporigeni termofili presenti nel latte e nei prodotti lattiero caseari (es. latte in polvere).
I bacilli termofili si coltivano in laboratorio su piastre di terreno nutritivo per aerobi (PLA o APC agar) incubate a 55°C.
Distinzione tra i ceppi batterici sporigeni
Gli sporigeni isolati con tale modalità dal latte UHT sono divisibili in due categorie:
- a) termofili obbligati e
- b) termofili facoltativi, denominati anche temotolleranti (Burgess & coll. 2010)
I termofili obbligati crescono solo a temperature elevate (tra 40° e70°C) e comprendono le speci Anoxybacillus flavitermus e Geobacillus spp. (Flint& coll.2001; Scott & coll.2007).
Gli sporigeni termofili facoltativi appartengono al genere Bacillus e crescono alle temperature proprie dei germi mesofili e a quelle dei termofili, in base alla specie. Alcuni esempi di questi sporigeni meso/termofili sono B. licheneformis, B. coagulans, B. pumilus, B. sporothermophilus e B. subtilis. (Burgess & coll, 2010).
Le caratteristiche principali dei bacilli termofili sono:
- temperatura massima di crescita :45°-70°C
- temperatura minima di crescita 30-47°C
- intervallo di pH per la crescita 5,2-9,0
- degradazione della caseina da parte della maggioranza dei ceppi
- scissione dell’amido da parte della maggior parte dei ceppi
Molti ceppi producono enzimi o altri prodotti metabolici che causano odori e difetti strutturali.
Latte contaminato: fonti di inquinamento
La provenienza dei ceppi sporigeni può essere identificata nelle stalle o negli impianti di trattamento termico del latte. Nelle stalle il suolo è l’habitat principale degli sporigeni; il foraggio e le lettiere contaminate contaminano capezzoli e mammelle dei bovini e da queste i germi passano
nel latte.
Il latte può subire quindi una contaminazione crociata da foraggio insilato di scarsa qualità microbica nel quale gli sporigeni possono essere presenti in quantità di 100-1000 ufc/ml.
Anche le macchine mungitrici sporche possono essere fonti di contaminazione così come le manualità non igieniche praticate dagli addetti alla mungitura.
Per quanto riguarda invece la loro presenza negli impianti di trattamento del latte, si possono trovare nei prepastorizzatori, nei preriscaldatori, e negli evaporatori e in altre parti degli impianti sottoforma di biofilm (Scott & Coll.20).
Caratteristiche dei bacilli termofili
I membri del genere Bacillus ed i bacilli termofili obbligati hanno semplici necessità nutrizionali: non richiedono infatti specifici aminoacidi per la loro crescita e, perciò, sono in grado di svilupparsi in terreni semplici (es. TSA).
La temperatura di crescita dei termofili obbligati è di solito compresa tra 55°C e 65°C, variando tra le specie ed i singoli ceppi della stessa specie.
Per i Bacilli termofili facoltativi le temperature di crescita sono riportate nella tabella n 1.
Le specie principali di termofili obbligati sono:
- Anoxybacillus flavithermus
- Geobacillus sterothermophilus
- Geobacillus thermoleovorans
Nella tabella n 1 sono riportate le caratteristiche dei bacilli termofili facoltativi ed obbligati
Il genere Geobacillus
Il genere è composto da almeno 19 specie diverse, con cellule bastoncellari che appaiono singole o in brevi catene mobili per mezzo di flagelli peritrichi.
Le specie di Geobacillus fanno parte del genere Geobacilus, famiglia Bacilaceae, ordine Bacillales,classe Bacilli,phylum Firmicutes.
Sono Gram positive, ma la colorazione può variare fino alla Gram negatività. Sono batteri chemio organotrofici, aerobi o anaerobi facoltativi. Sono ceppi obbligatoriamente termofili. Le temperature di crescita sono comprese tra 37°e 75° C, l’optimum di crescita è compreso tra 55°-65°C. La crescita avviene ad intervalli di pH compresi tra 6.0 e 6.5.
Le prove di identificazione richiedono la valutazione della loro attività nei confronti di carboidrati. I Geobacilli produco acido ma non gas da glucosio, fruttosio, maltosio, mannosio e saccarosio. Molte specie non producono acido dal lattosio.
Caratteristiche metaboliche di Geobacillus stearothermophilus
Oltre alle caratteristiche riportate in precedenza i ceppi della specie fermentano il glicerolo, il mannosio, ma non il lattosio e il galattosio. La sporulazione è una caratteristica fondamentale della specie. È favorita dalla presenza nel terreno di crescita da solfato e da cloruro di manganese.
Si produce in 10 giorni in substrato con pH 6-8,9. Il G. stearothermophilus è impiegato per la produzione di diversi enzimi quali le alfa-amilasi resistenti a 100°C per 1 h, la beta-mannasi termostabile, la proteasi alcalina extracellulare termostabile, l’alfa -L arabinofuranoside, la lipasi termostabile e la beta-xilosidasi.
Il microrganismo è responsabile dell’alterazione detta “Flat sour” o inacidimento senza produzione di gas. Lee sue spore possono trovarsi oltre che nel latte UHT anche nel latte concentrato scremato e nel latte in polvere.
Caratteristiche di Geobacillus thermoleovorans
Alle caratteristiche citate in precedenza si aggiungono lo sviluppo di colonie nei terreni di coltura con colore bianco e spesso con color crema, rugose in superficie. Produce acido dal cellobiosio, melobiosio, lattosio non tutti i ceppi), raffinosio, saccarosio e trealosio. Non scinde gli altri zuccheri (Dinsdale & coll,2011)
Caratteristiche di Anoxybacillus flavithermus
Anoxybacillus flavithermus fa parte del genere Anoxybacillus (18 specie),famiglia Bacillaceae,ordineBacillales,classe Bacilli,phylum Firmicutes.
Caratteristiche aggiuntive alle precedenti sono le seguenti: catalasi e ossidasi positivo. Utilizza glucosio, mannosio, maltosio, saccarosio, arabinosio, ramnosio e sorbitolo. Non cresce a 68°C (Pitula &coll.2000,Burgess & coll.2010).
Bacillus sporothermodurans e altri bacilli sporigeni termoresistenti nel latte UHT
Nel latte UHT possono trovarsi alcune specie di bacilli con spore resistenti ad alte temperature come Bacillus cereus, B. sphaericus, B. licheneformis, Brevibacillus brevis e due altre specie con forte capacità alterante: B. sporothermodurans e Paenibacillus lactis. Il B. spothermodurans è stato descritto da Pettersson & coll, (1996).Le principali caratteristiche del Bacillo sono riportate nella tabella n 1.
Le sue spore resistenti a 140°C per pochi secondi sono state isolate da diversi prodotti a base di latte (panna, latte con cioccolato, latte in polvere e latte ricostituito) (Hammer&coll.2000) alterati in seguito alla germinazione delle spore e alla moltiplicazione delle forme vegetative.
La specie B.sporothermodurans è geneticamente eterogenea, avendo cloni diversi raggruppabili in tre gruppi:I,II,III. Del primo gruppo fanno parte 16 ceppi, nel II e III sono collocati 3 ceppi ciascuno.
I ceppi per la crescita richiedono la presenza di vitamina B12 nel terreno di coltura. Le colonie sul terreno BHI agar si presentano piatte, circolari, intere, di colore beige o crema. Producono acido da glucosio, D-fruttosio e maltosio e deboli quantità da saccarosio e trealosio.
Brevibacillus brevis
I Brevibacillus sono bastoncini Gram positivi,mobili con flagellimperitrichi. Hanno spore ellissoidali entro sporangi rigonfi. Le colonie sono piatte, lisce, circolari, intere. Sono aerobi stretti, catalasi positivi e ossidasi negativi. Idrolizzano caseina,gelatina e DNA ma non amido ed urea.
Crescono a pH 5.5-5.6. La loro crescita è inibita dal 2% di NaCl. La temperatura ottimale di crescita è di 30 °C, la minima è 20°C e la massima 50°C. Producono acidi ma non gas dal D- fruttosio . La produzione di acido è invece variabile da D-glucosio, maltosio e D-ribosio. Non scindono altri zuccheri (Shida & coll.1995)
Paenibacillus lactis
P. lactis è stato isolato da latte non trattato e da latte UHT da Schedelman & coll. (2004). Una delle fonti principali di contaminazione risulta derivare dal mangime. Le spore resistono alla temperatura di 120 °C.
Le colonie si sviluppano su TSA in quattro giorni e si presentano opache, di color crema, leggermente convesse, rotonde con margini frastagliati e trasparenti. Le microcolonie, mobili, si distribuiscono sulla superficie dell’agar in senso orario.
Sono aerobiche. La temperatura massima di crescita è tra 50° e 55°C, mentre quella ottimale è compresa tra 30° e 40°C. Il pH ottimale per lo sviluppo è 7, quello minimo è tra 5.0 e 6.0,il pH più elevato di sviluppo è tra 10,5 e11. I bacilli non idrolizzano la caseina, ma scindono il beta-D-galattopiranoside.
I bacilli producono acido da L-arabinosio, D-cellobiosio, D-fruttosio, D-glucosio, glicogeno, lattosio, maltosio, mannitolo, D-mannosio, D-melibiosio, D-raffinosio, ribosio, amido, saccarosio e D- trealosio.
La produzione di acido è ceppo dipendente per D-arabinosio,L-I ceppi di Paenibacillus lactis fano parte del genere Paenibacillus, famiglia Paenibacillaceae, ordine Bacillales, classe Bacilli, phylum Firmicutes.
Potenziale capacità alterante di bacilli termofili obbligati e di termofili facoltativi
I ceppi di termofili obbligati e di termofili facoltativi producono acidi organici e vari enzimi termostabili, proteinasi e lipasi, alterando così latte e derivati.
I termofili obbligati posseggono una bassa capacità alterante poiché il latte ed i suoi derivati sono conservati a temperature inferiori a 37°C e a questa temperatura non crescono. Maggiormente alteranti sono, invece, i ceppi termofili facoltativi.
Le alterazioni da essi prodotte sono riportate nella tabella 2
| ALTERAZIONE | AGENTI RESPONSABILI |
| Inacidimento | Bacillus spp, Bacillus coagulans |
| Coagulazione dolce | Bacillus spp, Geobacillus stearothemophilus, Paenibacillus lactis |
| Rigonfiamento del contenitore | Bacillus spp. |
| Viscosità | Bacillus subtils, Bacillus licheniformis |
| Odori e sapori sgradevoli | B:cereus |
I termofili obbligati non sono patogeni. Alcuni termofili come B. licheneformis, B. pumilus e B.subtilis possono produrre tossine, ma solo a 30° e 37°C (De Jonge & coll.2009), B.cereus è in grado di alterare il latte, che diventa imbevibile.
Latte contaminato: termoresistenza di spore termofile
Nella tabella n.3 sono riportate le termoresistenze delle spore di termofili obbligati e facoltativi
| °C | Sopravvivenza | |
| Geobacillus sporothermophilus | 121°C | 42 sec |
| 143°C | 4 sec | |
| Anoxybacillus flavithermus | 143 °C | 3 sec |
| Bacillus licheneformis | 120 °C | 3 sec |
| 125°C | 4 sec | |
| Bacillus subtilis | 120°C | 4 sec |
| Bacillus pumilus | 135°C | 10 sec |
| Bacillus sporothermodurans | 125°C | 2 sec |
Presenza di termofili nel latte e biofilm quali fonti di contaminazione
La quantità di termofili nel latte è in genere inferiore a 10 ufc/ml (Hill & coll.1994;Guiggon & coll.2002) e solo in certe occasioni si sono riscontrate concentrazioni superiori a 100 uf/ ml. I termofili predominanti sono B. licheneformis e B. coagulans, ma nel latte UHT sono presenti solo G. sporothermophilus e A. flavithermus.
I termofili nell’impianto di pastorizzazione possono trovarsi nei biofilm. L’adesione dei batteri alle superfici e il conseguente sviluppo in biofilm è un’evenienza comune in ambienti naturali e negli impianti industriali.
I biofilm sono definiti come microcolonie di cellule batteriche racchiuse in una matrice extracellulare di sostanze polimeriche (EPS) sviluppatesi rapidamente sulle superfici.
La formazione di un biofilm si verifica in tre fasi:
Fase I (entro 1-10 sec.) su superfici ricoperte da componenti proteici del latte e con calcio fosfato
Fase II (entro 6-8 ore) avviene la colonizzazione primaria delle cellule batteriche nel substrato con formazione di esopolisaccaridi che supportano il processo
Fase III: si verifica la stabilizzazione irreversibile dei biofilm. Sono biofilm maturi con le cellule batteriche inclusi in canali all’interno della matrice organica. La formazione dei biofilm avviene nelle parti dell’impianto a temperature comprese tra 45° e 65 °C. Da queste formazioni si liberano i batteri che poi passano nel flusso del latte.
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Per quanto detto sinora, è evidente come il potenziale biofilmogeno dei microrganismi biofilmogeni rappresenti un ulteriore fattore di rischio nel garantire l’idonea shelf life del latte UHT, così come di altri prodotti trattati termicamente ad alte temperature.
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Bibliografia
- Burgess A; Lindsay D.; Flint S:H: & coll. (2010) Int. J. Food Microbiol. 144, 215-225
- Coorevits A; Dinsdale A.; Halket G.& coll. (2012) Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 62, 1470-1485
- De Jonghe V; Coorevitz A; De Block J. & coll. (2010) Int. J. Food Microbiol. 136, 318-325
- Griffith M.W. (1955) Bull. Int. Dairy Fed. 302,3-6
- Pikuta E. ; Lisenko A.M.; Chuvilakage N. & coll. (2002) Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53, 2019-2017
- Schedelman P.; Pi lA.; Herman L.; De Vos P. & coll: (2005 Appl. Env. Microbiol. 71, 148o-1494)
